꿈꾸는 블로그

중합효소 연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)

: 유전자 클로닝 방법

: 프라이머와 DNA 중합효소를 이용하여 미량의 시료에서 DNA를 증폭시켜 다량의 DNA를 얻을 수 있는 방법

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① DNA 변성 (denaturation)--> 94도에서 30초

② dna 결합 (annealing)--> 55도에서 1분

③ dna 신장(extension)--> 72도에서 1분

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사이클을 n번 반복시 2의 n승으로 dna가 증폭됨.

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--> 유전자 획득, 유전자 돌연변이 검출이나 돌연변이 제조, 유전자의 메틸화 검출, 유전자 패턴 검사, mRNA의 검출 및 정량화 등 다양하게 쓰인다.

초반에는

DNA 중합효소( 클레나우 절편)을 사이클마다 매번 넣어 주었다.

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주로 Taq중합효소를 사용한다.

고세균

단점

1. 낮은 정확도, 3->5번 방향으로 핵산 분해 및 교정 기능이 없다.

1,000,000 bp 당 2-~200bp 정도 오류를 일으킨다.

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2. 증폭시킬 수 있는 dna 크기 2kb 이하

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Primer를 잘 고안해야함.

- 적적한 길이와 서열

ex) 사람의 유천체를 표적으로 할 때 17bp 이상이 되어야함.

- pcr 온도 조건

두 프라이머의 Tm 값 중 낮은 것으로 부터 5도 정도 낮은 것이 최적 온도이다.

--> 두 프라이머의 Tm 값 차이가 많이 나면 증폭이 어렵다.

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hot start pcr : pcr 시작을 높은 온도에서 시작해 프라이머의 적절 결합 온도까지 내리는 방식 이용

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- 금속 이온의 농도와 종류

마그네슘 이온 요구 1~2mM 적합

- dNTP의 농도

뉴클레오타이드 농도도 일반적으로 0.2mM이상이면 적합

- 표적 DNA의 길이

2KB 이상의 유전자를 증폭하려면 교정 기능이 있는 내열성 중합효소가 적절함.

PCR 방법의 제한사항

- 이미 염기서열이 알려진 DNA만 증폭할 수 있다.

PCR로 유용 유전자를 얻는 경우 반드시 유전자 염기서열을 확인해야함.

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산물을 클로닝 벡터에 넣어야 할 때

① 제한효소 자리가 있는 프라이머를 이용하는 방법

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② ta 클로닝 방법

: 비첨착성 말단에 하나의 3- T가 돌출된 벡터와 PCR 산물을 연결하여 클로닝하는 것

T벡터: EcoRV와 같이 비점착성 말단을 형성하는 제한효소로 절단한 후 뉴클레오타이드 말단기 전달효소를 처리하여 3-T가 돌출되도록 제작

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③ 토포아이소머레이즈와 연결된 벡터를 이용하는 법

: 전사, 복제가 일어날 수 있도록 꼬여진 DNA 나선을 푸는 효소

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vaccina 토포아이소머레이즈

: 특정 서열을 인식하는 기능과 dna 가닥을 끊고 연결하는 기능을 함께 가짐.

1. 비점착성 말단 pcr 산물의 클로닝

--> pfu와 deep vent에 의해 생성된 산물 클로닝 가능

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2. 3 - t 말단 pcr 산물의 클로닝

==> taq나 Tth 등 산물의 클로닝 가능

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+ 실시간 PCR : 증폭된 DNA의 양을 실시간으로 측정

--> 정량적으로 조사하는 데 주로 사용

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총정리

중합효소 연쇄반응법은 총 3단계로 이루어지고, DNA 중합효소는 Taq를 주로 사용한다. pcr 최적화시키기 위해 여러가지 고려해야할 조건이 많다. 그리고 증폭이 제한되는 경우도 있다. 산물을 클로닝 시키는 방법에는 ta 클로닝, 제한효소 자리가 있는 프라이머를 이용하기, 토포아이소머레이즈와 연결된 벡터를 이용하기가 있다.

오늘은 혈장 혈청에 대해 알아보겠습니다.

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혈장 혈청에 대해 알아보기 전에, 혈액은 크게 혈장, 적혈구, 백혈구, 혈소판으로 구성되어있습니다.

혈장은 혈액의 대략 55%를 차지합니다.

여기서 혈장은 혈액- 세포 를 의미합니다.

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① 물

: 혈장의 90%는 물로 구성되어 있습니다.

물에는 무기염류가 녹아 있기 때문에 막전위, 삼투압, pH 등을 조절합니다.

그리고 우리 몸의 조직에서 생긴 열을 보존하고 피부 근처의 필요 없는 열을 방출하는 등 우리 몸의 체온을 조절합니다.

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② 단백질

혈장 단백질은 pH를 조절하고 삼투압에 영향을 줍니다.

( 혈장 단백질 농도가 줄어들면 혈장 교질삼투압이 줄어들고, 모세혈관 물질교환의 내압이 줄어들기 때문에 부종이 생길 수 있습니다.)

특별한 경우를 제외하고 혈장 단백질은 간에서 생성되는데요.

그 예로는 알부민, 피브리노겐, 글로불린(γ 글로불린 제외)이 있습니다.

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(1) 알부민 : 혈장 단백질 60%를 차지합니다.

빌리루빈, 지방산, 담즙산등을 수송하는 데 관여합니다.

(2) 피브리노겐: 혈액 응고에 관여합니다.

(3) 글로불린: 구형 단백질로, α,β- 글로불린은 지질, 철 이온을 수송하고, γ- 글로불린은 면역기능을 하는 항체 역할을 합니다.

( γ 글로불린은 α,β 글로불린과는 다르게 간에서 생성되지 않습니다.)

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혈청은 혈장 - 피브리노겐을 의미합니다.

다시 말하면 혈액 - 세포 - 피브리노겐입니다.

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- 내피세포, 백혈구 세포, 섬유아세포가 다양한 CSF들을 분비해 골수에서 백혈구 세포들의 생성과 분화를 조절합니다.

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혈액의 구성과 혈장 혈청에 대해 알아보았습니다.

1. 시료(호르몬)을 바닥에 고정합니다.

2. enzyme가 부착된 antibody를 투입해 1번과 붙게 합니다.

3. 결합하지 않은 항체를 씻어내고 기질을 첨가 해 항원의 양을 측정합니다.

1. 항원(호르몬)을 바닥에 부착합니다.

2. 사람의 혈액 샘플을 투여합니다. 샘플에 1차 항체가 있다면 호르몬과 결합합니다.

3. 결합하지 않은 샘플을 씻어내고 enzyme가 부착된 2차항체(검출 항체)를 1차 항체와 부착시킵니다.

4. 기질을 첨가해 발색반응을 관찰해 특정 혈액에 특정 호르몬이 있는지 확인합니다.

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--> 2차 항체는 검출용으로 사람과는 다른 동물의 종에서 생산해내야 합니다.

--> 2차 항체는 처음 antibody 항원으로 인식합니다.

--> 처음 항원은 호르몬과 결합하고 2차 항체(효소가 부착된)은 1차 항원과 결합하는 것이 특징입니다.

1. 정해진 양의 호르몬을 바닥에 부착합니다.

2. 호르몬과 항체가 붙어 있는 덩어리(?)를 투여합니다.

3. 상층액을 모두 씻어내고 효소가 부착된 2차 항체를 투입합니다.

4. 기질을 넣어 발색반응을 확인합니다.

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--> 시료 속 항원이 많을 수록 바닥의 호르몬과 결합하는 1차 항체의 양은 줄어들 것입니다.

1. 항체를 바닥에 고정하고 호르몬을 투입합니다.

2. 호르몬은 항체와 붙습니다.

3. 효소가 붙어있는 항체를 투여합니다.

4. 기질을 첨가해 발색 반응을 보고 항원의 양을 측정합니다.

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--> 호르몬이 중간에 샌드위치 처럼 낀 것이 특징입니다.

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이상 ELISA (enzyme linked immunoassay) 대해 알아보았습니다.

유전공학의 이해 제 3판

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C3. 핵산의 성질과 분리

-1. 핵산의 성질

(1)DNA의 변성과 재생

변성: DNA가 단일가닥 상태로 전이하는 것(고온, 높은 pH, 변성제)

↔ 재생(re-naturation): Tm 값보다 낮은 20~25℃ 정도에 놓아두면 다시 이중가닥 DNA로 바뀜.

+변성제= 요소, 구아니딘, 포름알데하이드, 포마마이드=강한 수소결합을 하는 화합물질

A260:DNA 용액을 260nm 파장에서 흡광도를 측정한 값

이중가닥: 1

단일가닥: 1.4

수소결합, 인산다이에스터 결합이 완전히 분해된 염기들: 1.6

→흡광 증가 효과: dna가 변성될 경우 흡광도가 증가하는 현상

Tm: 절반의 변성이 일어났을 때의 온도=변성온도

영향을 미치는 요인

①pH: NAOH용액 사용

→높은 pH 또한 수소 결합에 참여하는 많은 작용기의 전하량을 변화시키게 되어 염기쌍들간의 수소결합을 방해한다.

ex) 서던블롯팅

②이온 세기와 크기

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③염기의 조성: GC함량이 증가할수록 Tm값 커짐.

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(2)혼성화(hybridization)

:서로 다른 유래의 다른 단일가닥 핵산이 상보적으로 결합하여 이중가닥을 이루는 것

hybrid duplex: DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 사이에서 형성가능

(3) DNA와 RNA의 안정성

DNA는 안정하고, RNA는 불안정하다.

RNA의 경우, 2번 탄소에 붙어 있는 OH기가 물리적인 근접성으로 인해 알칼리 조건에서 RNA의 당-인산 골격 축을 끊고 새로운 인산기와 결합하려고 당-인산 골격을 공격하여 매우 불안정한 상태이다.

→RNA용액이 –70℃의 저온에서 보관되어야 함.

RNase:

증기멸균에 의해서도 파괴되지 않는 안정된 효소이다.

피부,땀, 침등에 존재한다.

→실험 시 RNase의 활동을 철처하게 차단해야함.

-2. 핵산의 분리 및 정제

(1)플라스미드 DNA 분리

①세포용해액을 얻고,

②플라스미드 DNA를 분리해냄.

③순수한 플라스미드 DNA용액을 획득

마지막 단계 에탄올 침전법 대신에..

실리카 흡착법: 친매성 기질 이용한 방법/ chaotropic 염이 있을 때 실리카 수지가 핵산과 서로 결합하는 성질을 이용한 것

이온교환수지 칼럼 방법

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(2) 세포의 유전체 DNA 분리온

① 세포 용해

② 단백질과 RNA의 제거

③ DNA 추출

④ 분리된 DNA의 양과 순도 측정

(3) 파지 DNA의 분리

① 배양 단계

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② 파지 입자의 분리 단계

-DEAE 셀룰로오스같은 음이온 교환수지를 이용하는 방법

-염화세슘 밀도기울기를 이용한 원심분리 방법

-글리세롤 계단 기울기를 이용한 방법

-PEG와 함께 초고속 원심분리

③ 파지 껍질 제거 및 DNA 추출

-SDS,단백질 가수분해효소 K로 껍질 제거 후 페놀 클로로포름 추출법을 사용

-포마이드-에

탄올 침전법을 혼용해 사용하기도 함.

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(4) RNA 분리

-세포나 조직의 분쇄, 단백질의 분해와 제거, RNA의 농축,양,질

-세포 내부 RNase, RNase 오염으로 인한 RNA 분해

내부: 추출 용액에 RNase 억제제=ATA, vanadyl-ribonucleoside 복합체, RNasin, guandium chloride, guanidium thio - chyanate

외부: RNase 제거를 위해 DEPC가 쓰임.

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전체 rna 분리 방법 3가지

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(5) mRNA의 분리

올리고 dT가 결합된 수지를 채운 다음, 진핵세포의 mRNA를 흘려보내 mRNA(3′말단에 폴리 A꼬리가짐.)가 dT를 결합시킨다. 염분 농도를 조절하여 rRNA,tRNA를 씻어내고 Tris-EDTA용액으로 mRNA를 용출시킨다.

(6) 핵산의 침전(precipitaion)과 보관

*알코올 침전법: 에탄올,이소프로판올 이용

염(salt)의 종류

아세트산암모늄 10 2.0~2.5M

염화리튬 5~8 0.5~0.8M

염화 나트륨 3 0.2M

아세트산나트륨 pH 5.2 0.3M농도0.2M

*보관

(7) 핵산의 농도 측정(spectroscopy:분광광도계)

핵산 수용액의 농도 측정: pH7, 260nm에서 자외선을 흡수하려는 성질이 최댓값이다.

→퓨린, 피리미딘 염기가 가지는 방향족 구조로 인해서...

핵산의 순도 측정: OD A260/A280의 비율 계산: 단백질 오염 여부

→단백질에 포함된 타이로신,트립토판과 같은 아미노산이 280nm에서 최대 흡수도 를보임.

출처: 네이버 지식백과 티로신/트립토판

OD(Optical Density) A260/A230의 비율: 230nm에서 페놀,염,단백질 등이 높은 흡광도를 보임.

순수하게 분리된 핵산

OD A260/A280:1.8~2.0

OD A260/A230: 1.8이상

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핵산의 성질과 분리 방법에 대해 알아보았다.

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