Mini prep, 페놀/클로로폼 추출법

Mini prep(미니 프렙)(미니 프랩)

: 대장균이 증폭한 플라스미드를 다시 얻는 방법

① 원심분리한 박테리아를 얻는다.

② 용액Ⅰ(50mM 포도당, 10mM EDTA, 25mM Tris HCI(pH 8) 섞고 현탁

→EDTA는 2가 양이온을 제거하고, 세포벽을 불안정하게 만든다.

→포도당은 삼투압을 맞춰 세포가 갑자기 터져서 DNA가 깨지지 않게 한다.

③ 용액 Ⅱ(0.2N NaOH, 1% SDS) 첨가 후 혼합

→ NAOH는 단백질, DNA를 변성시킨다.

→ SDS는 세포막을 파괴한다.

④ 용액 Ⅲ(3M 아세트산 칼륨(pH 4.8)) 첨가 후 혼합

→ 아세트산 칼륨은 용액을 중화시킨다. 용해도가 낮은 PDS가 되서 침전한다.

→ 박테리아 DNA는 염기들이 소수성 결합을 하며 뭉쳐 침전되지만, 플라스미드 DNA는 다시 이중가닥을 형성할 수 있다.

⑤ 원심 분리 한다음 위층을 얻는다.

⑥ 이소프로판올을 첨가하고 원심 분리 후 아래층을 얻는다.

→이소프로판올: 플라스미드 DNA를 침전시킨다.

⑦ 침전물을 에탄올 70%로 세척하고, TE 완충액에 녹인다.

 

페놀 클로로포름 추출법

: 시료에서 단백질 제거, 순수한 dna를 분리하는 방법

① dna가 있는 시료에 NaCI을 200mM이 되도록 투여함.

② 페놀 클로로포름 용액을 처리하고, 원심분리함.

→페놀은 계면활성제역할, 단백질을 변성시킨다.

→DNA는 염과 에탄올을 처리해야 침전되다.

③ 물층을 분리해, 클로로포름을 넣고 다시 원심분리함.

④ 또, 물을 분리하고 100% 에탄올을 넣고 원심분리함.

→염과 함께 DNA 침전시킴.

⑤ 원심 분리 후 아래층을 얻고, 70% 에탄올로 세척함,

→70%에탄올은 염제거에 이용.

⑥침전물을 TE완충액에 녹임.

→TE 완충액: Dnase를 저해하는 EDTA 포함, DNA를 물보다 안전하게 보관할 수 있다.

미니 프랩과 페놀 클로로포름 추출법에 대해 알아보았다.