핵산의 성질과 분리

유전공학의 이해 제 3판

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C3. 핵산의 성질과 분리

-1. 핵산의 성질

(1)DNA의 변성과 재생

변성: DNA가 단일가닥 상태로 전이하는 것(고온, 높은 pH, 변성제)

↔ 재생(re-naturation): Tm 값보다 낮은 20~25℃ 정도에 놓아두면 다시 이중가닥 DNA로 바뀜.

 

+변성제= 요소, 구아니딘, 포름알데하이드, 포마마이드=강한 수소결합을 하는 화합물질

 

A260:DNA 용액을 260nm 파장에서 흡광도를 측정한 값

이중가닥: 1

단일가닥: 1.4

수소결합, 인산다이에스터 결합이 완전히 분해된 염기들: 1.6

→흡광 증가 효과: dna가 변성될 경우 흡광도가 증가하는 현상

 

Tm: 절반의 변성이 일어났을 때의 온도=변성온도

영향을 미치는 요인

①pH: NAOH용액 사용

→높은 pH 또한 수소 결합에 참여하는 많은 작용기의 전하량을 변화시키게 되어 염기쌍들간의 수소결합을 방해한다.

ex) 서던블롯팅

 

②이온 세기와 크기

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③염기의 조성: GC함량이 증가할수록 Tm값 커짐.

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(2)혼성화(hybridization)

:서로 다른 유래의 다른 단일가닥 핵산이 상보적으로 결합하여 이중가닥을 이루는 것

hybrid duplex: DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 사이에서 형성가능

 

(3) DNA와 RNA의 안정성

DNA는 안정하고, RNA는 불안정하다.

 

RNA의 경우, 2번 탄소에 붙어 있는 OH기가 물리적인 근접성으로 인해 알칼리 조건에서 RNA의 당-인산 골격 축을 끊고 새로운 인산기와 결합하려고 당-인산 골격을 공격하여 매우 불안정한 상태이다.

→RNA용액이 –70℃의 저온에서 보관되어야 함.

 

RNase:

증기멸균에 의해서도 파괴되지 않는 안정된 효소이다.

피부,땀, 침등에 존재한다.

→실험 시 RNase의 활동을 철처하게 차단해야함.

-2. 핵산의 분리 및 정제

(1)플라스미드 DNA 분리

①세포용해액을 얻고,

②플라스미드 DNA를 분리해냄.

③순수한 플라스미드 DNA용액을 획득

 

알칼리 용해
끓이기 방법	고온과 세제로 박테리아 세포 용해시킴 원심분리로 박테리아 dna, 막 등 복합체를 침전시킴 증류수에 녹여 순수한 플라스미드 dna를 얻음.

마지막 단계 에탄올 침전법 대신에..

실리카 흡착법: 친매성 기질 이용한 방법/ chaotropic 염이 있을 때 실리카 수지가 핵산과 서로 결합하는 성질을 이용한 것

이온교환수지 칼럼 방법

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(2) 세포의 유전체 DNA 분리온

① 세포 용해

② 단백질과 RNA의 제거

③ DNA 추출

④ 분리된 DNA의 양과 순도 측정

박테리아	①동결 해동법이나 라이소자임에 의한 방법으로 세포를 용해시킨다. ​ ② SDS, 단백질 가수분해효소 K, RNase를 처리해 단백질 및 RNA를 제거한다. ​ ③ 페놀 클로로포름 추출법,(요즘은 페놀 추출법 대신 실리카 흡착법을 사용하기도 한다.) 에탄올 침전법을 활용해 DNA를 추출해낸다.
동물세포
식물세포	①식물 분쇄: 액체 질소 이용하여 막자사발 이용 ②세포 용해:세포 용액에 CTAB(양이온 세제, 음전하를 띈 DNA와 0.5M 이하의 염조건에서 불용성의 복합체를 형성) ③용해된 세포에서 dna추출과 농축: 원심분리 시 복합체가 침전되고, 고농도의 염용액에 용해시켜 실리카 흡착법, 에탄올 침전법으로 순수하게 분리

(3) 파지 DNA의 분리

① 배양 단계

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② 파지 입자의 분리 단계

-DEAE 셀룰로오스같은 음이온 교환수지를 이용하는 방법

-염화세슘 밀도기울기를 이용한 원심분리 방법

-글리세롤 계단 기울기를 이용한 방법

-PEG와 함께 초고속 원심분리

 

③ 파지 껍질 제거 및 DNA 추출

-SDS,단백질 가수분해효소 K로 껍질 제거 후 페놀 클로로포름 추출법을 사용

-포마이드-에

탄올 침전법을 혼용해 사용하기도 함.

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(4) RNA 분리

-세포나 조직의 분쇄, 단백질의 분해와 제거, RNA의 농축,양,질

-세포 내부 RNase, RNase 오염으로 인한 RNA 분해

내부: 추출 용액에 RNase 억제제=ATA, vanadyl-ribonucleoside 복합체, RNasin, guandium chloride, guanidium thio - chyanate

외부: RNase 제거를 위해 DEPC가 쓰임.

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전체 rna 분리 방법 3가지

hot phenol	안토시아닌이나 페놀 화합물과 탄수화물 등이함된 많이 포함된 식물조직으로 전체 rna 분리시, 핫 페놀로 추출 후 높은 농도의 염화리튬 침전 방법으로 rna를 순수 분리
트리졸=페놀과 guandine isothiocyanate가 하나의 액상	rna를 분리하고, 높은 염 농도에서 아이소프로판올을 이용한 침전법으로 rna를 회수한다.
guanidine thiocyanate	산성 조건하에 4M의 guanidine thiocyanate를 포함하는 용액속에서 수용액상에 위치며, dna와 단백질은 페놀 클로로폼의 유기 용매상에 위치한다는 사실 기반으로 개발

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(5) mRNA의 분리

올리고 dT가 결합된 수지를 채운 다음, 진핵세포의 mRNA를 흘려보내 mRNA(3′말단에 폴리 A꼬리가짐.)가 dT를 결합시킨다. 염분 농도를 조절하여 rRNA,tRNA를 씻어내고 Tris-EDTA용액으로 mRNA를 용출시킨다.

 

(6) 핵산의 침전(precipitaion)과 보관

*알코올 침전법: 에탄올,이소프로판올 이용

에탄올	핵산으로부터 물 분자를 제거→음전하를 띈 인산기를 노출시킴→반대 전하를 가진 이온이 결합하여 폴리뉴클레오티드 사슬 사이 반발력을 감소시켜 침전을 일으킴. 1가 양이온의 존재 하에 농도 70% 알코올에서 수행됨.
이소프로판올	낮은 농도에서도 dna 침전 가능 낮은 휘발성으로 dna시료에서 완전히 제거 어렵다. →70%에탄올로 dna 침전물을 여러번 씻겨줌.

염(salt)의 종류

아세트산암모늄 10 2.0~2.5M

염화리튬 5~8 0.5~0.8M

염화 나트륨 3 0.2M

아세트산나트륨 pH 5.2 0.3M농도0.2M

 

*보관

DNA	DNA 분해가 최소가 되는 조건으로 저장해야 함. 단기적:4~6℃ 보관 장기적: 탈아마이드화 방지 최소 pH 8.5이상, 최소 0.15M NaCI과 10mM의 EDTA를 포함하는 용액에서.
RNA	RNase가 없는 증류수나 TE완충액에 녹인 후 분리한 당일에 사용하는 것이 바람직 -80℃ 액체 질소에 보관 소량으로 나누어 보관

(7) 핵산의 농도 측정(spectroscopy:분광광도계)

핵산 수용액의 농도 측정: pH7, 260nm에서 자외선을 흡수하려는 성질이 최댓값이다.

→퓨린, 피리미딘 염기가 가지는 방향족 구조로 인해서...

핵산의 순도 측정: OD A260/A280의 비율 계산: 단백질 오염 여부

→단백질에 포함된 타이로신,트립토판과 같은 아미노산이 280nm에서 최대 흡수도 를보임.

 

 

출처: 네이버 지식백과 티로신/트립토판

OD(Optical Density) A260/A230의 비율: 230nm에서 페놀,염,단백질 등이 높은 흡광도를 보임.

 

순수하게 분리된 핵산

OD A260/A280:1.8~2.0

OD A260/A230: 1.8이상

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핵산의 성질과 분리 방법에 대해 알아보았다.

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