형질전환된 박테리아 세포 선발 방법

재조합 플라스미드 벡터를 형질전환 확인하는 방법으로는 3가지가 있다.

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1. 항생제

2. Lac Z 비활성화

3. 콜로니 PCR

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1. 항생제

항생제 선발표지자

: 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 테트라사이클린

카나마이신: 30S 리보솜에 결합하여 mRNA의 번역시 코돈을 잘못 인식하게 함으로써 단백질 합성의 최초 단계를 저해

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2, 삽입 비활성화 메커니즘

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베타 갈락토시데이즈는 X gal을 갈락토오스와 인디고염료(산화 시 청색을 띔)으로 분해한다.

베타 갈락토시데이즈는 알파 상호작용에 의해 생성된다.

+IPTG: 플라스미드의 Lac Z 유전자 발현 유도

'

대장균은 원래 온전한 베타 갈락토시데이즈 생성 가능

알파 상보작용에 사용되는 균주는 알파 절편을 생성할 수 없는 균주여야 한다.

--> DH-5α, JM109 등 lacZΔRM15돌연변이 균주 사용

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결론:

MCS 사이트에 삽입시 : 콜로니는 흰색 ( 알파 절편 X, W 절편 O)

MCS 사이트에 비삽입시: 콜로니는 청색 ( 알파 절편 O, W 절편 O)

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3. 콜로니 pcr

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도입된 유전자에 존재하는 것과 동일한 프라이머를 이용해 PCR에 의해 삽입된 유전자를 확인

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주형 DNA : 순수 분리한 재조합 플라스미드. 분리 과정 없이 박테리아 콜로니 자체를 주형으로 사용

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지금까지 형질전환된 박테리아 세포를 선발하는 방법을 알아보았다.

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